細胞內(nèi)抗原的檢測過程與細胞表面抗原檢測過程基本一致,只是在與一抗孵育前,需要預(yù)先對細胞用非離子去污劑進行透化處理。
操作方法
1. 取已固定好的細胞爬片或甩片或經(jīng)過預(yù)處理的組織切片(石蠟或冰凍切片);
2. 用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細胞2min(室溫),有些標本可能需要長達15min,時間視抗原而定;
3. 余下步驟接上述“ 注意事項 1. 在使用前,一抗二抗均應(yīng)測試其合適的稀釋度。 2. 多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的,標本經(jīng)多聚甲醛固定后,應(yīng)再用去污劑處理,如果標本在水溶液中浸泡的時間過長,則會使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此,應(yīng)避免固定后的標本在水溶液中浸泡的時間過長。 3. 信號微弱的解決方法: ① 提高一抗和二抗的濃度以增強敏感性 ,這必須測試各種濃度抗體的滴度; ② 延長一抗和二抗的孵育時間。由于細胞染色時抗原吸附在固相載體上,抗原抗體結(jié)合時間較在溶液中長。孵育時間可因?qū)嶒炘O(shè)計作適當調(diào)整,但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在以上兩點中,應(yīng)摸索出一個*條件以產(chǎn)生有效信號且保持良好的背景。這就需要反復(fù)試驗,因為每組抗體和抗原的情況會有所不同; ③ 改變檢測方法,用共聚焦顯微鏡觀察,可提高敏感性。