蛋白質(zhì)的分離純化方法
沉淀法：原理：是使蛋白質(zhì)膠體顆粒的表面水化膜或表面電荷破壞，從而使蛋白質(zhì)沉淀。
• 鹽析法
• 有機(jī)溶劑沉淀法
• 等點(diǎn)電沉淀法
• 選擇性變性沉淀法
• 聚合物沉淀法
在生物大分子制備中zui常用的幾種沉淀方法是：
• 中性鹽沉淀（鹽析法）：zui大的特點(diǎn)是環(huán)境溫和，不易造成蛋白質(zhì)變性。因此適用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。缺點(diǎn)是分辨率底，且后續(xù)處理時(shí)需要除鹽。
• 有機(jī)溶劑沉淀：分辨率高于鹽析法，但容易引起目的蛋白失活。所以多用于生物小分子的分離純化比如多肽、寡肽。
• 等電點(diǎn)沉淀：其局限是，須事先了解蛋白的PI；且沉淀過(guò)程中可能發(fā)生變性和失活，部分蛋白等電點(diǎn)沉淀后不容易溶解，因此較少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其他方法結(jié)合使用。
• 選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。三氯yi醚是比較常用的酸變性劑，尤其在分析樣品的濃縮而不需考慮活性的條件下用得多。
• 有機(jī)聚合物沉淀：是發(fā)展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇作為沉淀劑，常用PEG6000和20000。它條件溫和，不易變性，且沉淀效果強(qiáng)，很少量的PEG可沉淀大量的蛋白。缺點(diǎn)是PEG除去比較困難。
根據(jù)分子大小不同：超濾法、透析法（膜分離法）、超速離心法、 凝膠過(guò)濾法（GF）也稱大小排阻層析，是一種根據(jù)分子的大小和形狀來(lái)進(jìn)行分離的方法。不同的蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠微孔時(shí)因遷移能力不同而被分離。利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，（在其分離范圍內(nèi)）按分子大小將樣品中各組份分離開來(lái)。大分子先被洗脫，小分子后被洗脫。應(yīng)用：脫鹽 Sephadex G10、25，中間純化 Sephadex G200，精純 Sephacryl 、Superdex。常用填料：Sephadex系：是以氯代環(huán)氧丙烷進(jìn)行交聯(lián)的葡聚糖珠狀凝膠，經(jīng)典的凝膠介質(zhì)。Sepharose系:經(jīng)過(guò)純化的瓊脂糖，含極少的帶電集團(tuán)。型號(hào)zui多、應(yīng)用zui廣。Sephacryl系：有是丙基葡聚糖與N,N’-亞甲基雙丙稀酰胺共聚而成，經(jīng)濟(jì)。Superdex系：是葡聚糖與瓊脂糖共聚而成的復(fù)合凝膠，，選擇性強(qiáng)，分辨率*。
• 凝膠類型：葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。
• 葡聚糖凝膠：直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3—氯1，2—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。
凝膠回收處理方法：將樣品*洗脫下來(lái)后，繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。
G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5mL，G-100表示 1g干膠持水10mL，依次類推。葡聚糖凝膠和生物膠多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脫緩沖液充分溶賬。在室溫下讓其充分溶賬脹達(dá)到平衡，通常需要較長(zhǎng)時(shí)間。較快的做法是將干膠往水里加，邊加邊攪，以防凝膠結(jié)塊，然后放到沸水浴中加熱接近100℃，幾個(gè)小時(shí)就可以使其溶脹，還可起到除去顆粒內(nèi)部氣泡和殺菌作用。新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用3～5倍體積的緩沖液在恒壓下流過(guò)柱床。新裝好的柱要檢驗(yàn)其均勻性－可用帶色的高分子物質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過(guò)柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對(duì)光檢查，看其是否均勻或有無(wú)氣泡存在。
蛋白質(zhì)的分離純化方法
凝膠用過(guò)后，有幾種保存方法：
濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；
濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；
干燥保存：水洗后濾干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥（或60～80℃烘干）后保存。加乙醇時(shí)，切忌一上來(lái)就用濃乙醇處理，以防結(jié)塊
對(duì)生物樣品來(lái)說(shuō)，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無(wú)機(jī)鹽。我們知道，蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D，而無(wú)機(jī)鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用Sephadex G-25凝膠作為分離固定相，因?yàn)樗姆蛛x范圍是1000～5000D。被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，其Kd值的差可達(dá)zui大值1。對(duì)于分子量小于5000D的肽類進(jìn)行脫鹽操作則常選用Sephadex G-15凝膠。
另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級(jí)分離。后者對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作要求都比較高。下面以zui常用的葡聚糖凝膠類為例，分別加以討論 。
葡聚糖凝膠離子交換劑使用方法
新購(gòu)進(jìn)的陽(yáng)離子交換劑（如CM-Sephadex C-25）為Na型，陰離子凝膠交換劑（如DEAE-Sephadex A-25）為Cl-型，使用前要按一般離子交換劑的使用方法進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。1g陰離子交換劑約用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min后減壓過(guò)濾，充分洗滌，再用等量0.5mol／L HCL處理，洗至中和備用。陽(yáng)離子交換劑lg約用100mL 0.5mol／L HCL浸泡20min后過(guò)濾，充分洗滌，再用等量0.5mo1／L NaOH溶液處理20min，洗至中性備用。將以上處理好的葡聚糖凝膠離子交換劑，用20～30倍量與層析時(shí)所用的同種緩沖液浸泡（但濃度要高，如0.1～0.5mol／L），再用同種酸或堿調(diào)節(jié)至所需要pH值，放置1h后，待pH值不變即可減壓過(guò)濾。
| 型號(hào) | 分離范圍Da | 粒徑 | 建議流速cm/h |
| Sepharose 2B | 70-40,000 | 60-200 | 10 |
| Sepharose 4B | 60-20,000 | 45-165 | 11.5 |
| Sepharose 6B | 10-40,000 | 45-165 | 14 |
| Sepharose CL-2B | 70-40,000 | 25-75 | 15 |
| Sepharose CL-4B | 60-20,000 | 25-75 | 26 |
| Sepharose CL-6B | 10-40,000 | 25-75 | 30 |
| Sepharose 6 | 5-5,000 | 20-40 | 30 |
| Sepharose 12 | 1-300 | 20-40 | 30 |
| Sepharose FF 6 | 10-4,000 | 平均90 | 300 |
| Sepharose FF 4 | 60-20,000 | 平均90 | 250 |
• 根據(jù)分子所帶電荷差異電泳法、等電聚焦等。離子交換層析法（IEX）：原理：首先是根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電類型（陽(yáng)離子或陰離子），然后根據(jù)其相對(duì)電荷強(qiáng)度進(jìn)行分離。PH：陰離子交換層析：蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，則要求PH>PI，但不能高于介質(zhì)功能基團(tuán)的PK；陽(yáng)離子交換層析：蛋白質(zhì)帶正電荷，則要求PH<PI，但不能低于介質(zhì)功能基團(tuán)的PK；緩沖溶液：陰離子交換層析：Tris-HCl 陽(yáng)離子交換層析：PB。帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)。陽(yáng)離子交換劑 — 帶負(fù)電荷，與陽(yáng)離子交換；陰離子交換劑 — 帶正電荷，與陰離子交換。
常見問題分析：
不吸附：緩沖溶液PH不對(duì)；離子強(qiáng)度太高；
峰形不穩(wěn)或出現(xiàn)奇異峰：柱床中有氣泡或緩沖溶液不純
分辨率低：梯度太大；流速太高
前沿峰：柱過(guò)載；填充效果差；柱需再生
峰拖尾：樣品在柱濾膜上或凝膠床頂部沉淀
基線隨梯度上移：鹽濃度臨近CMC
1.離子交換樹脂
2.離子交換纖維素
§ 陰離子交換纖維素 —如:DEAE-纖維素 pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙基
§ 陽(yáng)離子交換纖維素—如:CM-纖維素 一般pH>4條件下使用,具有羧甲基
3.離子交換凝膠— 分離大分子物質(zhì)
離子交換劑的選擇考慮因素：
1.被分離物質(zhì)帶何種電荷
2.被分離物質(zhì)分子的大小
大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素
3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境
4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)
5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量
根據(jù)疏水性不同：疏水層析（HIC）、反相色譜（RPC）： 原理：是指固定相的極性低于流動(dòng)相的極性，在這種層析過(guò)程中，極性大的分子比極性小的分子遷移速度快而先被洗脫下來(lái)。一般使用甲醇、乙腈作流動(dòng)相，使得蛋白質(zhì)容易變性失活；常用于HPLC分析，與在水-有機(jī)相中穩(wěn)定的多肽和低分子量蛋白質(zhì)的分離。
蛋白質(zhì)的分離純化方法
梯度淋洗裝置
外梯度:利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。
內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。
示差折光檢測(cè)器：可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；
親和層析（AC）：
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